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韦斯卡VS维戈塞尔塔: 一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法.pdf

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一種 RGD 靶向 卟啉 聚合物 納米 膠束 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310360627.3

申請日:

2013.08.16

公開號:

CN103432582B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 41/00申請日:20130816|||公開
IPC分類號: A61K41/00; A61K9/19; A61P35/00 主分類號: A61K41/00
申請人: 中國醫學科學院生物醫學工程研究所
發明人: 馬桂蕾; 宋存先
地址: 300192 天津市南開區白堤路236號
優先權:
專利代理機構: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201 代理人: 李麗萍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310360627.3

授權公告號:

103432582B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2014.01.15|||2013.12.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,步驟是:1)將RGD通過酰胺鍵連接在卟啉-兩親性嵌段共聚物;2)將步驟1)制備的產物和疏水性藥物溶于丙酮中;3)將步驟2)制成的溶液加入到水溶液中,攪拌揮發,除去丙酮;4)離心,收集固化的納米微粒,冷凍干燥即得到RGD靶向卟啉聚合物納米膠束。本發明的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束集腫瘤主動靶向功能、光-化療協同抗腫瘤功能于一體,具有自身的光敏活性及進一步負載化學藥物的抑瘤活性,在主動靶向和協同抗腫瘤作用下能夠增強腫瘤治療效果。

權利要求書

權利要求書
1.  一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟一、按摩爾比1:1~50的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在20~30℃下反應18~72小時,從而使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物上;
步驟二、按質量比為9~1:1的比例,將步驟一制備的產物和疏水性藥物溶于丙酮中制成質量百分比濃度為0.1~10%的溶液A;
步驟三、按體積比1:1~100的比例,將步驟二制成的溶液A以0.5~5ml/min的速度加入到水溶液中制成溶液B;
步驟四、在10~30℃下,將溶液B減壓以除去其中的丙酮制成溶液C;
步驟五、在0~10℃下,以15000~25000rpm轉速離心處理溶液C20~40min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥后得到粒徑為20nm-500nm的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束。

2.  根據權利要求1所述一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,其中,所述含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物選自:含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物、含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物、含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物和含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物中的一種。

3.  根據權利要求1所述一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,其中,所述疏水性藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇和脫鹽阿霉素中的一種。

4.  根據權利要求1所述一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,最終得到粒徑為100nm的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束。

說明書

說明書一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法
技術領域
本發明涉及一種納米膠束的制備方法,尤其涉及一種聚合物納米膠束的制備方法。
背景技術
隨著社會老齡化和人們生活方式的改變,惡性腫瘤已成為人類的“第一殺手”。臨床上可選擇的腫瘤治療手段包括手術治療,化學藥物治療、放射療法、光動力治療以及熱療等方法,癌癥的多誘發因素導致其應用任一單一治療手段均療效不佳,死亡率仍逐年上升。運用腫瘤的多手段綜合治療,實現不同治療方法之間的協同及互補,將極大提高抗腫瘤療效,增加患者生存率,是目前惡性腫瘤治療的新趨勢。納米醫學的出現為腫瘤的多手段綜合治療提供了一個理想的功能性平臺。
腫瘤光動力治療(photodynamic therapy,PDT)是一種新興的腫瘤治療方法,自1996年被美國FDA批準進入臨床后,已應用于如皮膚癌,頭頸癌,肺癌等多種腫瘤疾病的治療。同其它腫瘤治療手段相比,PDT的優勢在于具有低毒性,無多藥耐藥性,另外PDT可激活機體抗腫瘤免疫反應的能力使其在治療轉移性腫瘤方面具有極大潛力。光敏劑是PDT治療的核心物質,但現有的光敏劑常存在水溶性差,易聚集以及對靶細胞選擇性低等缺點,從而極大限制了PDT在臨床上的廣泛應用。研究開發具有主動靶向傳輸、協同治療(如光-化療)等組合功能為一體的“功能型光敏劑”,為腫瘤的多手段綜合治療提供一種新途徑,將從根本上改善目前惡性腫瘤的治療效果。
發明內容
針對上述現有技術,本發明提供一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,本發明獲得的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束具有自身的光敏活性,通過進一步負載化學藥物實現化療療效,解決了藥物共同輸送載體藥物包埋率低的技術問題;另外通過RGD的靶向作用將藥物載體遞送到腫瘤細胞內部,解決了非靶向藥物遞送載體對靶細胞選擇性低的技術問題。
為了解決上述技術問題,本發明一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束的制備方法,包括以下步驟:
步驟一、按摩爾比1:1~50的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在20~30℃下反應18~72小時,從而使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的卟啉-兩親 性嵌段共聚物上;
步驟二、按質量比為9~1:1的比例,將步驟一制備的產物和疏水性藥物溶于丙酮中制成質量百分比濃度為0.1~10%的溶液A;
步驟三、按體積比1:1~100的比例,將步驟二制成的溶液A以0.5~5ml/min的速度加入到水溶液中制成溶液B;
步驟四、在10~30℃下,將溶液B減壓以除去其中的丙酮制成溶液C;
步驟五、在0~10℃下,以15000~25000rpm轉速離心處理溶液C20~40min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥后得到粒徑為20nm-500nm的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束。
進一步講,本發明中的所述含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物選自:含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物、含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物、含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物和含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物中的一種。
本發明中的所述疏水性藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇和脫鹽阿霉素中的一種。
與現有技術相比,本發明的有益效果是:
本發明獲得的一種RGD靶向卟啉聚合物納米膠束集腫瘤靶向功能、光-化療協同抗腫瘤功能于一體,通過膠束表面的RGD肽實現靶向識別和定位腫瘤病灶功能;通過膠束載體中的光敏劑卟啉實現光動力抗腫瘤療效;通過膠束遞送的疏水性藥物實現化療抗腫瘤作用,提出了惡性腫瘤綜合治療載藥體系設計的新理念。
附圖說明
圖1是本發明RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束透射電鏡圖;
圖2是本發明RGD靶向載疏水性藥物卟啉聚合物納米膠束對荷人乳腺癌MCF-7實體瘤模型裸鼠抑瘤效果曲線圖;
圖3是尾靜脈給藥后荷人乳腺癌MCF-7實體瘤模型裸鼠的腫瘤大小的比較圖,其中:1為生理鹽水組,2是未靶向修飾卟啉聚合物納米膠束組,3是未靶向修飾載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組,4是采用本發明獲得的RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組。
具體實施方式
以下通過實施例講述本發明的詳細過程,提供實施例是為了理解的方便,絕不是限制本發明。
實施例1:
本實施例1中,所選取的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物為含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,選取的疏水性藥物為紫杉醇,制備RGD靶向紫杉醇卟啉聚合物納米膠束的步驟如下:
1)按摩爾比1:25的含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在25℃下反應45小時,使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物上;
2)按質量比為4.5:1的比例,將步驟1)制備的產物和紫杉醇溶于丙酮中制成質量百分比濃度為5.05%的溶液A;
3)按體積比1:50的比例,將步驟2)制成的溶液A以2.8ml/min的速度加入到水溶液中制成溶液B;
4)在20℃下,對溶液B減壓以除去其中的丙酮制成溶液C減壓除去丙酮;
5)在5℃下,對溶液C以20000rpm的轉速離心30min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥,至此,得到一種RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束。
實施例2:
本實施例2中,所選取的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物為含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,選取的疏水性藥物為多烯紫杉醇,制備RGD靶向多烯紫杉醇卟啉聚合物納米膠束的步驟如下:
1)按摩爾比1:1的含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在20℃下反應72小時,使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物上;
2)按質量比為1:1的比例,將步驟1)制備的產物和多烯紫杉醇溶于丙酮中制成質量百分比濃度為0.1%的溶液A;
3)按體積比1:1的比例,將步驟2)制成的溶液A加入到水溶液中制成溶液B,其加入速度為0.5/min;
4)在10℃下,對溶液B減壓除去其中的丙酮;
5)在0℃下,對溶液C以15000rpm的轉速離心40min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥,至此,得到一種RGD靶向多烯紫杉醇卟啉聚合物納米膠束。
實施例3:
本實施例3中,所選取的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物為含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,選取的疏水性藥物為脫鹽阿霉素,制備RGD靶向阿霉素卟啉聚合物納米膠束的步驟如下:
1)按摩爾比1:50的含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在30℃下反應18小時,使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物上;
2)按質量比為9:1的比例,將步驟1)制備的產物和阿霉素溶于丙酮中制成質量百分比濃度為10%的溶液A;
3)按體積比1:100的比例,將步驟2)制成的溶液A加入到水溶液中制成溶液B,其加入速度為5ml/min;
4)在30℃下,對溶液B減壓除去其中的丙酮;
5)在10℃下,對溶液C以25000rpm的轉速離心20min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥,至此,得到一種RGD靶向阿霉素卟啉聚合物納米膠束。
實施例4:
本實施例4中,所選取的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物為含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,選取的疏水性藥物為多烯紫杉醇,制備RGD靶向多烯紫杉醇卟啉聚合物納米膠束的步驟如下:
1)按摩爾比1:30的含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在25℃下反應48小時,使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物上;
2)按質量比為9:1的比例,將步驟1)制備的產物和多烯紫杉醇溶于丙酮中制成質量百分比濃度為0.2%的溶液A;
3)按體積比1:40的比例,將步驟2)制成的溶液A加入到水溶液中制成溶液B,溶液A的加入速度為2ml/min;
4)在10℃下,對溶液B減壓除去其中的丙酮;
5)在5℃下,對溶液C以25000rpm的轉速離心處理30min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥,至此得到一種RGD靶向多烯紫杉醇卟啉聚合物納米膠束。
實施例5:
目前,卟啉-兩親性嵌段共聚物的合成有許多方法,本實施例5以5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物為例采用封管本體熔融聚合法,包括下述步驟:
首先,分別將一定量的丙交酯,乙交酯,5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉以及含有催化劑辛酸亞錫的二氯甲烷溶液加入到封管中(摩爾比按需加入,最常用為120:40:1或180:60:1),抽真空以除去有機溶劑,氮氣?;は掠?0~180℃恒溫箱中反應4~16小時,反應結束后得到產物5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯。
然后,分別將一定量的上述產物與雙端羧基聚乙二醇(摩爾比按需加入,最常用為1:15或1:20),在碳化二亞胺類交聯劑催化下室溫反應24~96小時后得到5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇兩親性嵌段共聚物。
以卟啉-兩親性嵌段共聚物作為本發明納米膠束的載體材料,該兩親性共聚物在保留聚乙丙交酯和聚乙二醇所固有的優良生物相容性和兩親性特征的同時,可賦予該載體材料光敏性能。卟啉-兩親性嵌段共聚物可自組裝形成核殼結構的納米膠束,該膠束具有良好的光敏活性可用于惡性腫瘤的光動力治療,同時其疏水性內核可負載抗腫瘤藥物,進而實現光動力聯合化療協同治療惡性腫瘤功能,將極大提高抗腫瘤療效。RGD靶分子與卟啉-兩親性嵌段共聚物的端羧基通過共價鍵結合,使得靶分子的結構更趨穩定,結合更加牢固,偶聯有RGD肽的卟啉-兩親性嵌段共聚物自組裝形成具有核殼結構的膠束后,PEG親水層的高端基自由度使其在體內復雜環境中能靈活機動地導向RGD靶分子,從而可極大提高靶細胞與靶分子結合的能力。
本發明的RGD靶向卟啉聚合物納米膠束集腫瘤靶向功能、光-化療協同抗腫瘤功能于一體,提出了惡性腫瘤綜合治療載藥體系設計的新理念,為腫瘤的多手段綜合治療提供了一種新途徑,將從根本上改善目前惡性腫瘤的治療效果。
另外,本發明中,所述5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,5,15-二(3-羥基苯基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物的區別在于:與靶分子RGD肽結合的活性位點不同,也就是提供的端羧基量不同,其順序為5-(3-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物<5,15-二(3-羥基苯 基)-10,20-二苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物<5,10,15-三(3-羥基苯基)-20-苯基卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物<5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物。
實施例6:
本實施例6中,所選取的含端羧基的卟啉-兩親性嵌段共聚物為含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物,選取的疏水性藥物為紫杉醇,制備RGD靶向紫杉醇卟啉聚合物納米膠束的步驟如下:
1)按摩爾比1:30的含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物與RGD肽混合,加入與所述含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物分子中的端羧基等當量的碳化二亞胺類交聯劑,在25℃下反應48小時,使RGD肽通過酰胺鍵連接在所述含端羧基的5,10,15,20-四(3-羥基苯基)卟啉/聚乙丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物上;
2)按質量比為9:1的比例,將步驟1)制備的產物和紫杉醇溶于丙酮中制成質量百分比濃度為0.2%的溶液A;
3)按體積比1:20的比例,將步驟2)制成的溶液A加入到水溶液中制成溶液B,溶液A的加入速度為2ml/min;
4)在10℃下,對溶液B減壓除去其中的丙酮;
5)在5℃下,對溶液C以25000rpm的轉速離心處理30min,收集固化的納米微粒,冷凍干燥,得到一種RGD靶向紫杉醇卟啉聚合物納米膠束。
圖1示出了實施例6最終得到的納米膠束的透射電鏡圖,由圖1可以看出該納米膠束具有明顯的核殼結構,膠束的粒徑在100nm左右。本發明制備得到的納米膠束的粒徑范圍為20nm-500nm,最佳粒徑約為100nm。至于如何控制本發明最終產品的粒徑,對于本技術領域人員來說屬于公知常識,在此不再贅述。
本實施例6獲得的RGD靶向紫杉醇卟啉聚合物納米膠束對荷人乳腺癌MCF-7實體瘤模型裸鼠抑瘤效果如圖2和圖3所示。其中,圖2是本發明RGD靶向載疏水性藥物卟啉聚合物納米膠束對荷人乳腺癌MCF-7實體瘤模型裸鼠抑瘤效果曲線圖;其中顯示了生理鹽水組,RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組,未靶向修飾載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組以及未靶向修飾卟啉聚合物納米膠束組的對照曲線。圖3是尾靜脈給藥后荷人乳腺癌MCF-7實體瘤模型裸鼠的腫瘤大小的比較圖,其中:1為生理鹽水組,2是未靶向修飾卟啉聚合物納米膠束組,3是未靶向修飾載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組,4是采用本發明獲得的RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組。
實驗表明在相同劑量下,制備的RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束對腫瘤抑制左右較強,與未靶向修飾載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組和未靶向修飾卟啉聚合物納米膠束組相比,制備的RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束組的腫瘤體積明顯減小,給藥后第21天,三個實驗組的抑瘤率分別為:(76.6±3.7)%、(54.5±2.9)%和(35.3±1.6)%,制備的RGD靶向載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束顯示出高效低毒的治療效果。
圖2和圖3中顯示的未靶向修飾載紫杉醇卟啉聚合物納米膠束的制備方法同實施例6,只是在步驟1)中未加入RGD肽。未靶向修飾卟啉聚合物納米膠束的制備方法同實施例6,只是在步驟1)中未加入RGD肽,并且在步驟2)中未加入紫杉醇。
盡管上面結合圖對本發明進行了描述,但是本發明并不局限于上述的具體實施方式,上述的具體實施方式僅僅是示意性的,而不是限制性的,本領域的普通技術人員在本發明的啟示下,在不脫離本發明宗旨的情況下,還可以作出很多變形,這些均屬于本發明的?;ぶ?。

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