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维戈塞尔塔主场迎战塞维利亚: 偽狂犬病毒疫苗的生產方法.pdf

摘要
申請專利號:

维戈塞尔塔vs皇家社会 www.vmyqew.com.cn CN201310529245.9

申請日:

2013.10.31

公開號:

CN103550772B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/245申請日:20131031|||公開
IPC分類號: A61K39/245; A61P31/22; C12N7/04; C12R1/93(2006.01)N 主分類號: A61K39/245
申請人: 成都天邦生物制品有限公司
發明人: 徐宏軍; 胡來根; 任麗; 張奕強; 岳豐雄
地址: 610000 四川省成都市龍泉驛經濟技術開發區靈池路
優先權:
專利代理機構: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213 代理人: 劉興亮
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310529245.9

授權公告號:

103550772B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2014.03.12|||2014.02.05

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,包括以下步驟:(1)取傳代細胞系細胞,經消化傳代,以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養;(2)將毒種用細胞維持液稀釋10倍,接種細胞單層,收獲感染細胞毒液,即為生產用毒種;(3)取步驟(1)中已形成的細胞單層,經消化制備為細胞懸液,接種于生物反應器中,在生物反應器中加入微載體;(4)對細胞進行接毒操作,所接入毒種為步驟(2)中生產的毒種;(5)待微載體上細胞全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,去除微載體及細胞碎片,制得偽狂犬病毒疫苗。本發明生產周期短、產量大。

權利要求書

權利要求書
1.  一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)制苗用細胞的傳代與培養:取細胞培養瓶中生長良好的傳代細胞系細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代,以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養,培養溫度為37℃,形成細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種細胞單層,培養48~72小時,當細胞病變達75%以上時,收獲感染細胞毒液,即為生產用毒種;
(3)傳代細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)中已形成的細胞單層,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,按5×105/mL~5×106/mL的細胞密度接種于生物反應器中,在生物反應器中加入微載體,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:當細胞達到5×106/mL~5×107/mL后進行接毒操作,所接入毒種為步驟(2)中生產的毒種,接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培養液將長滿細胞的微載體洗滌2~4次,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(5)偽狂犬病毒疫苗的收獲:待微載體上細胞全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗。

2.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,步驟(1)中所述的傳代細胞系為BHK-21細胞系、PK-15細胞系、IBRS-2細胞系、 Marc-145細胞系、Vero細胞系或ST細胞系。

3.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的生物反應器,所述生物反應器的容積為3L~3000L。

4.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述微載體為以交聯葡聚糖為基質,用帶有正電荷的N,N-二乙氨乙基基團進行取代的Cytodex系列微載體。

5.  根據權利要求4所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述微載體在使用前需清洗、滅菌,具體方法為:用PBS浸泡微載體過夜,然后用PBS清洗微載體3遍,再用PBS浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌30分鐘,微載體經清洗、滅菌處理后,加入到已滅菌的生物反應器中,用高糖型DMEM清洗。

6.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述EDTA-胰酶細胞分散液是由質量體積分數為0.25%的規格為1:250的胰酶、質量體積分數為0.02%的EDTA的Hank's液組成,所述規格1:250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶。

7.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述細胞生長液由重量分數90%~98%的DMEM液、重量分數2%~10%的牛血清及100~500單位/ml的抗菌素組成,所述細胞生長液pH為6.8~7.6。

8.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述步驟(4)中的病毒培養液為含有胰酶的DMEM液,且DMEM液中含有100~500單位/ml的抗菌素,所述病毒培養液pH為6.8~7.6。

9.  根據權利要求7或8所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述 抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。

10.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述步驟(4)中的毒種接種量為0.01~0.5MOI。

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狂犬病毒 疫苗 生產 方法
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