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维戈塞尔塔vs皇家贝蒂斯分析: 偽狂犬病毒疫苗的生產方法.pdf

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狂犬病毒 疫苗 生產 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310529245.9

申請日:

2013.10.31

公開號:

CN103550772B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/245申請日:20131031|||公開
IPC分類號: A61K39/245; A61P31/22; C12N7/04; C12R1/93(2006.01)N 主分類號: A61K39/245
申請人: 成都天邦生物制品有限公司
發明人: 徐宏軍; 胡來根; 任麗; 張奕強; 岳豐雄
地址: 610000 四川省成都市龍泉驛經濟技術開發區靈池路
優先權:
專利代理機構: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213 代理人: 劉興亮
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310529245.9

授權公告號:

103550772B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2014.03.12|||2014.02.05

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,包括以下步驟:(1)取傳代細胞系細胞,經消化傳代,以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養;(2)將毒種用細胞維持液稀釋10倍,接種細胞單層,收獲感染細胞毒液,即為生產用毒種;(3)取步驟(1)中已形成的細胞單層,經消化制備為細胞懸液,接種于生物反應器中,在生物反應器中加入微載體;(4)對細胞進行接毒操作,所接入毒種為步驟(2)中生產的毒種;(5)待微載體上細胞全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,去除微載體及細胞碎片,制得偽狂犬病毒疫苗。本發明生產周期短、產量大。

權利要求書

權利要求書
1.  一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)制苗用細胞的傳代與培養:取細胞培養瓶中生長良好的傳代細胞系細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代,以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培養,培養溫度為37℃,形成細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種細胞單層,培養48~72小時,當細胞病變達75%以上時,收獲感染細胞毒液,即為生產用毒種;
(3)傳代細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)中已形成的細胞單層,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,按5×105/mL~5×106/mL的細胞密度接種于生物反應器中,在生物反應器中加入微載體,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:當細胞達到5×106/mL~5×107/mL后進行接毒操作,所接入毒種為步驟(2)中生產的毒種,接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培養液將長滿細胞的微載體洗滌2~4次,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(5)偽狂犬病毒疫苗的收獲:待微載體上細胞全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗。

2.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,步驟(1)中所述的傳代細胞系為BHK-21細胞系、PK-15細胞系、IBRS-2細胞系、 Marc-145細胞系、Vero細胞系或ST細胞系。

3.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的生物反應器,所述生物反應器的容積為3L~3000L。

4.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述微載體為以交聯葡聚糖為基質,用帶有正電荷的N,N-二乙氨乙基基團進行取代的Cytodex系列微載體。

5.  根據權利要求4所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述微載體在使用前需清洗、滅菌,具體方法為:用PBS浸泡微載體過夜,然后用PBS清洗微載體3遍,再用PBS浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌30分鐘,微載體經清洗、滅菌處理后,加入到已滅菌的生物反應器中,用高糖型DMEM清洗。

6.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述EDTA-胰酶細胞分散液是由質量體積分數為0.25%的規格為1:250的胰酶、質量體積分數為0.02%的EDTA的Hank's液組成,所述規格1:250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶。

7.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述細胞生長液由重量分數90%~98%的DMEM液、重量分數2%~10%的牛血清及100~500單位/ml的抗菌素組成,所述細胞生長液pH為6.8~7.6。

8.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述步驟(4)中的病毒培養液為含有胰酶的DMEM液,且DMEM液中含有100~500單位/ml的抗菌素,所述病毒培養液pH為6.8~7.6。

9.  根據權利要求7或8所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述 抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。

10.  根據權利要求1所述偽狂犬病毒疫苗的生產方法,其特征在于,所述步驟(4)中的毒種接種量為0.01~0.5MOI。

說明書

說明書偽狂犬病毒疫苗的生產方法
技術領域
本發明實施例涉及一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,具體涉及一種利用生物反應器微載體細胞懸浮培養生產偽狂犬病毒疫苗的方法。
背景技術
目前,國內偽狂犬病毒的疫苗生產唯一依靠轉瓶培養法實現。該傳統工藝勞動強度大,耗時長、效率低,生產成本高;容易被環境污染;轉瓶培養不同批次間的差異大;所需空間多;轉瓶培養操作時被細菌或其它病毒污染可能性增大,因而致生產的疫苗或有質量隱患;轉瓶培養時一旦發生污染,由于轉瓶數量多,因而無害化處理難度大,涉及生物安全和公共衛生問題。另外,目前已經有利用生物反應器微載體培養狂犬病疫苗的報道,但尚沒有利用生物反應器微載體生產偽狂犬病毒的報道。
發明內容
本發明的目的在于解決上述現有技術的缺陷,提供一種生產成本低、生產周期短的應用生物反應器微載體細胞培養生產偽狂犬病毒疫苗的方法。
為解決上述的技術問題,本發明采用以下技術方案:一種偽狂犬病毒疫苗的生產方法,包括以下步驟:
(1)制苗用細胞的傳代與培養:取細胞培養瓶中生長良好的傳代細胞系細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代,以細胞生長液在細胞培養瓶中繼續培 養,培養溫度為37℃,形成致密細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種細胞單層,培養48~72小時,當細胞病變達75%以上時,收獲感染細胞毒液,即為生產用毒種;
(3)傳代細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)中已形成的細胞單層,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,按5×105/mL~5×106/mL的細胞密度接種于生物反應器中,在生物反應器中加入微載體,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:當細胞達到5×106/mL~5×107/mL后進行接毒操作,所接入毒種為步驟(2)中生產的毒種,接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培養液將長滿細胞的微載體洗滌2~4次,設定培養條件為:溫度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和攪拌速度30~60轉/分鐘;
(5)偽狂犬病毒疫苗的收獲:待微載體上細胞全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,步驟(1)中所述的傳代細胞系為BHK-21細胞系、PK-15細胞系、IBRS-2細胞系、Marc-145細胞系、Vero細胞系或ST細胞系。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的生物反應器,所述生物反應器的容積為3L~3000L。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述微載體為以交聯葡聚糖為基質,用帶有正電荷的N,N-二乙氨乙基基團進行一定程度取代的Cytodex系列微載體。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述微載體在使用前需清洗、滅菌,具體方法為:用PBS浸泡微載體過夜,然后用PBS清洗微載體3遍,再用PBS浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌30分鐘,微載體經清洗、滅菌處理后,加入到已滅菌的生物反應器中,用高糖型DMEM清洗,PBS為磷酸鹽緩沖液,pH=7.4,與人體血液等滲,主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀;DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基,分為高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述EDTA-胰酶細胞分散液是由質量體積分數為0.25%的規格為1:250的胰酶、質量體積分數為0.02%的EDTA的Hank's液組成,所述規格1:250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶,Hank's液是一種平衡鹽溶液。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述細胞生長液由重量分數90%~98%的DMEM液、重量分數2%~10%的牛血清及100~500單位/ml的抗菌素組成,所述細胞生長液pH為6.8~7.6。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述步驟(4)中的病毒培養液為含有胰酶的DMEM液,且DMEM液中含有100~500單位/ml的抗菌素,所述病毒培養液pH為6.8~7.6。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。
在上述偽狂犬病毒疫苗的生產方法中,優選的是,所述步驟(4)中的毒種接種量為0.01~0.5MOI,MOI指TCID50/cell,即病毒感染復數。
本發明的效果和優點如下:
1、本發明可以大大降低生產成本、占用場地小,不會受制于原料供應。
2、本發明生產周期短(每個生產周期僅需5~7天),產量大,相比現有轉瓶培養法所生產的偽狂犬病毒效價更高。
3、采用生物反應器進行疫苗生產,具有自動化程度高,減少人工,生產工藝簡單穩定、易操作,易于快速擴大生產規模,質量易于實現均衡穩定。
4、本發明的方法生產疫苗,環境污染少且易于處理。
附圖說明
圖1是本發明方法的生產流程圖。
具體實施方式
圖1是本發明方法的生產流程圖。
實施例一:(1)制苗用細胞的傳代與培養:選擇乳倉鼠腎(BHK-21)細胞系作為制苗用細胞。取細胞培養瓶中生長良好的BHK-21細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液(含0.25%胰酶(1:250)、0.02%EDTA的Hank's液)消化傳代,以細胞生長液(含90%DMEM液、10%牛血清、各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為7.4)在細胞培養瓶中繼續培養,培養溫度為37℃,形成致密良好細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養,其中生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的適用于微載 體懸浮培養的生物反應器;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種生長良好的BHK-21細胞單層,培養55小時,隨時觀察細胞病變(CPE),當細胞病變達75%以上時,收獲感染細胞毒液,經鑒定合格后作為生產用毒種;
(3)BHK-21細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)培養好的BHK-21細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,細胞計數后接種于生物反應器中,在生物反應器中加有微載體,設定培養溫度37℃、pH7.4、溶氧50%、攪拌速度60轉/分鐘,進行反應器自動控制培養,其中生物反應器容積為75L;微載體為Cytodex系列微載體,微載體在使用前,需清洗、滅菌,具體步驟為:1)稱量Cytodex1微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜;2)用10LPBS液清洗3遍;3)加入10LPBS液浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌三十分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:培養后第三日觀察微載體上細胞基本長滿,且細胞計數結果為9.6×106/ml后進行接毒操作,接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養液(病毒培養液配方為:不含血清,含有胰酶的DMEM液、加各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為7.4)洗滌4次。接種量為0.1MOI,設定培養溫度37℃、pH7.4、溶氧50%、攪拌速度60轉/分鐘,進行反應器自動控制培養,接毒后每隔一定時間取反應器中微載體,用顯微鏡觀察細胞病變情況;
(5)病毒液的收獲:待微載體上細胞基本全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗,于-20℃冷凍保存備用。
對偽狂犬病毒疫苗進行檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附 錄42、49頁進行檢驗,無細菌、霉菌、支原體生長。收獲的毒液進行病毒含量測定,計算TCID50,每0.1ml病毒含量≥107.5TCLD50。
(6)配苗、分裝及凍干:將檢驗合格的偽狂犬病毒疫苗與穩定劑按1:1比例混合,同時加入抗生素,充分搖勻,定量分裝,分裝后進行冷凍真空干燥后即得偽狂犬病毒疫苗成品。
成品檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗,符合“偽狂犬細胞活疫苗”的規定,每頭份疫苗病毒含量≥103.7TCLD50。
實施例二:(1)制苗用細胞的傳代與培養:選擇豬腎(PK-15)細胞系作為制苗用細胞。取細胞培養瓶中生長良好的PK-15細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液(含0.25%胰酶(1:250)、0.02%EDTA的Hank's液)消化傳代,以細胞生長液(含98%DMEM液、2%牛血清、各250單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為7.0)在細胞培養瓶中繼續培養,培養溫度為37℃,形成良好細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養,其中生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的適用于微載體懸浮培養的生物反應器;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種生長良好的PK-15細胞單層,培養72小時,隨時觀察細胞病變(CPE),當細胞病變達82%時,收獲感染細胞毒液,經鑒定合格后作為生產用毒種;
(3)PK-15細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)培養好的PK-15細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,細胞計數后接種于生物反應器中,在生物反應器中加有微載體,設定培養溫度37℃、pH7.0、溶氧60%、攪拌速度60轉/分鐘,進行反應器自動控制培養,其中生物反應器容積為 75L;微載體為Cytodex系列微載體,微載體在使用前,需清洗、滅菌,具體步驟為:1)稱量Cytodex1微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜;2)用10LPBS液清洗3遍;3)加入10LPBS液浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌三十分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:培養后第三日觀察微載體上細胞基本長滿,且細胞計數結果為4.6×107/ml后進行接毒操作,接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養液(病毒培養液配方為:不含血清,含有胰酶的DMEM液、加各200單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為7.0)洗滌4次。接種量為0.1MOI,設定培養溫度37℃、pH7.0、溶氧60%、攪拌速度60轉/分鐘,進行反應器自動控制培養,接毒后每隔一定時間取反應器中微載體,用顯微鏡觀察細胞病變情況;
(5)病毒液的收獲:待微載體上細胞基本全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗,于-20℃冷凍保存備用。
對偽狂犬病毒疫苗進行檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄42、49頁進行檢驗,無細菌、霉菌、支原體生長。收獲的毒液進行病毒含量測定,計算TCID50,每0.1ml病毒含量≥108.5TCLD50。
(6)配苗、分裝及凍干:將檢驗合格的偽狂犬病毒疫苗與穩定劑按1:1比例混合,同時加入抗生素,充分搖勻,定量分裝;分裝后進行冷凍真空干燥后即得偽狂犬病毒疫苗成品。
成品檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗,符合“偽狂犬細胞活疫苗”的規定,每頭份疫苗病毒含量≥103.7TCLD50。。
實施例三:(1)制苗用細胞的傳代與培養:選擇猴腎(Marc-145)細胞系作為制苗用細胞。取細胞培養瓶中生長良好的Marc-145細胞,經EDTA-胰酶細 胞分散液(含0.25%胰酶(1:250)、0.02%EDTA的Hank's液)消化傳代,以細胞生長液(含94%DMEM液、6%牛血清、各100單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為6.8)在細胞培養瓶中繼續培養,培養溫度為37℃,形成良好細胞單層時,用于繼續傳代或接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養,其中生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度參數的適用于微載體懸浮培養的生物反應器;
(2)制苗用毒種的繁殖:將毒種用DMEM細胞培養基配制的細胞維持液稀釋10倍,接種生長良好的Marc-145細胞單層,培養60小時,隨時觀察細胞病變(CPE),當細胞病變達85%時,收獲感染細胞毒液,經鑒定合格后作為生產用毒種;
(3)Marc-145細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養:取步驟(1)培養好的Marc-145細胞,經EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液,細胞計數后接種于生物反應器中,在生物反應器中加有微載體,設定培養溫度37℃、pH6.8、溶氧50%、攪拌速度50轉/分鐘,進行反應器自動控制培養,其中生物反應器容積為75L;微載體為Cytodex系列微載體,微載體在使用前,需清洗、滅菌,具體步驟為:1)稱量Cytodex1微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜;2)用10LPBS液清洗3遍;3)加入10LPBS液浸泡微載體,121℃蒸汽滅菌三十分鐘;
(4)制苗毒液的繁殖:培養后第三日觀察微載體上細胞基本長滿,且細胞計數結果為9.0×106/ml后進行接毒操作,接毒前用含有10ug/ml胰酶的病毒培養液(病毒培養液配方為:不含血清,含有胰酶的DMEM液、加各100單位/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素,pH為6.8)洗滌4次。接種量為0.3MOI,設定培養溫度37℃、pH6.8、溶氧50%、攪拌速度60轉/分鐘,進行反應器自動控制培養, 接毒后每隔一定時間取反應器中微載體,用顯微鏡觀察細胞病變情況;
(5)病毒液的收獲:待微載體上細胞基本全部脫落,且溶解氧值呈明顯上升趨勢,將反應器內液體連同微載體一起收獲,置與-20℃條件下反復凍融2次,然后經離心或過濾去除微載體及細胞碎片,即制得偽狂犬病毒疫苗,于-20℃冷凍保存備用。
對偽狂犬病毒疫苗進行檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄42、49頁進行檢驗,無細菌、霉菌、支原體生長。收獲的毒液進行病毒含量測定,計算TCID50,每0.1ml病毒含量≥108.3TCLD50。
(6)配苗、分裝及凍干:將檢驗合格的偽狂犬病毒疫苗與穩定劑按1:1比例混合,同時加入抗生素,充分搖勻,定量分裝;分裝后進行冷凍真空干燥后即得偽狂犬病毒疫苗成品。
成品檢驗:按《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗,符合“偽狂犬細胞活疫苗”的規定,每頭份疫苗病毒含量≥103.7TCLD50。。
在本說明書中所談到的“一個實施例”、“另一個實施例”、“實施例”、等,指的是結合該實施例描述的具體特征、結構或者特點包括在本申請概括性描述的至少一個實施例中。在說明書中多個地方出現同種表述不是一定指的是同一個實施例。進一步來說,結合任一實施例描述一個具體特征、結構或者特點時,所要主張的是結合其他實施例來實現這種特征、結構或者特點也落在本發明的范圍內。
盡管這里參照本發明的多個解釋性實施例對本發明進行了描述,但是,應該理解,本領域技術人員可以設計出很多其他的修改和實施方式,這些修改和實施方式將落在本申請公開的原則范圍和精神之內。更具體地說,在本申請公開、附圖和權利要求的范圍內,可以對主題組合布局的組成部件和/或布局進行 多種變型和改進。除了對組成部件和/或布局進行的變型和改進外,對于本領域技術人員來說,其他的用途也將是明顯的。

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