• / 32
  • 下載費用:30 金幣  

阿拉维斯一维戈塞尔塔预测: ?。俸詡に剞卓辜良跋喙胤椒?pdf

關 鍵 詞:
激素 拮抗劑 相關 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN96192639.2

申請日:

1996.01.16

公開號:

CN1179105A

公開日:

1998.04.15

當前法律狀態:

撤回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的視為撤回||||||公開
IPC分類號: A61K38/04 主分類號: A61K38/04
申請人: 小馬克·奎倫; 錢納K·杰亞威克里姆; 邁克爾R·勒納
發明人: 小馬克·奎倫; 錢納K·杰亞威克里姆; 邁克爾R·勒納
地址: 美國康涅狄格州
優先權: 1995.01.17 US 08/373,151
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 吳玉和;溫宏艷
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN96192639.2

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2004.07.14|||1998.04.22|||1998.04.15

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的視為撤回|||實質審查請求的生效|||公開

摘要

本文公開α-促黑激素的肽類拮抗劑以及抑制此激素對其敏感細胞或組織的作用的方法。具體地說,公開的是皮膚色素沉著的增白方法和治療惡性黑色素瘤的方法,以及應用本發明的試劑盒。

權利要求書

1: α-促黑激素的肽類拮抗劑,其具有包含R-S-T的氨基酸序列, 其中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、 Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化 物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當 S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其 酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、 Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時, R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met 和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、 Arg、D-Arg及其酰胺化物。
2: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它是一種三肽。
3: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Arg-Leu。
4: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Arg-Nle。
5: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Arg-Nva。
6: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Arg-Met。
7: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Arg-D-Nle。
8: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Lys-Nle。
9: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -D-Arg-Nle。
10: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Leu-Nle。
11: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Trp -Nle-Nle。
12: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列D-Phe -Arg-Nle。
13: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列Tyr-Arg -Nle。
14: 權利要求1的α-促黑激素的拮抗劑,它具有氨基酸序列Ac-D -Trp-Arg-Nle。
15: 一種在α-促黑激素響應細胞或組織中抑制α-促黑激素活性的方 法,其包括將所述細胞或組織與有效劑量的α-促黑激素的肽類拮抗劑接 觸,其中所述肽類拮抗劑包含氨基酸序列R-S-T,其中R、S和T 是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、 Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化物時,R是D- Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當S是Lys、D- Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其酰胺化物時,R 是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、 Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時,R是D-Trp;S 選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu;T選自 Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg 及其酰胺化物。
16: 一種使動物膚色增白的方法,其包括給動物施用有效量的α-促黑 激素的肽類拮抗劑,其中所述肽類拮抗劑包含氨基酸序列R-S-T,其 中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、 Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化 物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當 S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其 酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、 Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時, R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met 和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、 Arg、D-Arg及其酰胺化物。
17: 權利要求16的方法,其中所述動物是人。
18: 權利要求16的方法,其中所述肽類拮抗劑是局部施用的。
19: 權利要求16的方法,其中所述拮抗劑是通過選自局部施用、全身性 注射和口服施用的方法施用的。
20: 權利要求16的方法,其中所述肽類拮抗劑是三肽。
21: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg -Leu。
22: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg -Nle。
23: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg -Nva。
24: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg -Met。
25: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg -D-Nle。
26: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Lys -Nle。
27: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-D -Arg-Nle。
28: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Leu -Nle。
29: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Nle -Nle。
30: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列D-Phe-Arg -Nle。
31: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列Tyr-Arg- Nle。
32: 權利要求20的方法,其中所述三肽具有氨基酸序列Ac-D-Trp -Arg-Nle-NH 2 。
33: 一種治療惡性黑色素瘤的方法,其包括給動物施用有效量的肽,所 述肽具有包含R-S-T的氨基酸序列,其中R、S和T是氨基酸殘基, R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D- His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Phe、D- Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當S是Lys、D-Arg、Leu、 Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Trp; 當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、 Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時,R是D-Trp;S選自Arg、Lys、 D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、 Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。
34: 一種包含肽的藥物組合物,所述肽具有包含R-S-T的氨基酸序 列,其中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D- Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其 酰胺化物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D- His;當S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是 Nle或其酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、 Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化 物時,R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、 Met和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、 Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。
35: 權利要求32的藥物組合物,其中所述藥用載體選自適于局部應用的 溶液、乳油或洗液,適于全身性注射的生理鹽或緩沖劑,適于口服施用的 緩釋載體和組合物。
36: α-促黑激素的肽類拮抗劑,它是用包括如下步驟的方法鑒定的: a.制備一種組合文庫,該文庫包含隨機序列三肽分子的文庫; b.篩選所述組合文庫,以檢測拮抗促黑激素的活性; c.鑒定具有所述拮抗α-促黑激素的活性的三肽分子。
37: 一種試劑盒,其在一個或多個容器中包含α-促黑激素的肽類拮抗 劑,所述肽類拮抗劑選自D-Trp-Arg-Leu,D-Trp-Arg-Nle, D-Trp-Arg-Nva,D-Trp-Arg-Met,D-Trp-Arg-D -Nle,D-Trp-Arg-Ile,D-Trp-Arg-Abu,D-Trp-Arg -Val,D-Trp-Arg-Arg,D-Trp-Arg-D-Arg,D-Trp -Lys-Nle,D-Trp-D-Arg-Nle,D-Trp-Leu-Nle,D -Trp-Nle-Nle,D-Trp-Ala-Nle,D-Trp-Met-Nle, D-Trp-Abu-Nle,D-Phe-Arg-Nle,D-Tyr-Arg-Nle, D-Ac-Trp-Arg-Nle,Trp-Arg-Nle和D-His-Arg-Nle 或其酰胺化物。
38: 權利要求37的試劑盒,其在一個或多個容器中還包含適于施用所述 α-促黑激素的肽類拮抗劑的藥用載體。

說明書


α-促黑激素拮抗劑及其相關方法

    1.前言

    本發明提供α-促黑激素的肽類拮抗劑,并提供抑制α-促黑激素對其敏感細胞或組織的作用的方法,包括增白皮膚、調節免疫應答和治療惡性黑色素瘤。

    2.發明背景

    皮膚的色素沉著和顏色變深與表皮黑素小體中黑色素的含量及分布有關。表皮細胞群包括角化細胞和黑色素細胞,后者通過樹狀突起為角化細胞提供黑素小體,即含有黑色素的色素顆粒。黑色素即黑色色素,它是這樣產生的:在酪氨酸酶的催化下,將酪氨酸氧化成多巴和多巴醌,其所生成的化合物再聚合成黑色素。

    局部過度色素沉著有許多種,目前還缺乏安全有效的美容治療方法。這些色素沉著包括色斑,如雀斑、太陽痣(亦稱肝痣)、黑色棘皮病(一種黑色素過度性失調)、牛奶咖啡斑、痣、黃褐斑(產后局部皮膚變暗)。調節全身皮膚色調的方法一直是人們關注和需要的,其目的是為了美容,例如增白皮膚,或者阻止由內分泌失調引起的外觀損害。到目前為止,還沒有完全有效的方法用于調節表皮色素沉著的色調。

    與色素沉著的調節有關地內源激素是α-促黑激素(“α-MSH”)(Lerner等,1961,Nature?189,176-179)。α-MSH還與下列因素有關:中樞神經系統及免疫系統功能的調節(De?Weid,1993,Ann.NYAcad.Sci.680,20-28;Tatro,1990,Brain?Res.536,124-132;Luger等,1993,Ann.NY?Acad.Sci.680,567-570;Cannon等,1986,J.Immunol.137,2232-2236;Murphy等,1983,Science?221,192-193),生長(Strand,F.l.等,1993,Ann.NY?Acad.Sci.680,29-49),細胞分裂(Halaban等,1993,J.Ann.NY?Acad.Sci.689,290-300),以及黑素瘤(Varga等,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71,1590-1593)。

    對α-促黑激素是皮膚基本色調的內源調節因子的假設的間接支持來自一些實驗,在這些實驗中,摘除魚類、兩棲類和低等哺乳類的垂體會誘導其色素沉著減輕(Chavin,1956,J.Exp.Zool.133,1-36;Smith,1916,Science?44,75-758;Allen,1916,Science?44,755-758;Rust,C.C.,1965,Gen.Comp.Endocrinol.5,222-231)。

    此外,一些臨床實例報道稱,當人由于疾病或垂體切除而導致垂體功能喪失時會變得異常蒼白(Felig等,1987.Endocrinology?and?MetabolismMcGraw-Hill?Book?Company,New?York,1-26)。對人類,不僅垂體釋放MSH,而且皮膚角化細胞在紫外光照射后也明顯釋放MSH(Luger等,1993,Ann.N.Y.Acad.Sci.680,567-570)。眾所周知,將MSH注射給動物或人會使皮膚色調超出基本色調水平。內源α-MSH對基本色調的色素沉著的貢獻,至今尚屬未知。

    已表明MSH可使培養的小鼠黑色素瘤細胞的酪氨酸酶活性增強?;狗⑾滯交赴輝諳赴芷詰腉2期對MSH有響應。125I標記的MSH的結合主要發生在G2期。因此,推測MSH可能通過結合到G2期細胞的MSH受體上激活黑色素瘤細胞腺苷酸環化酶(Varga等,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,71(5),1590-3)。

    因此,實用的α-MSH活性拮抗劑可提供確認內源α-MSH作用的藥劑,并提供調節α-MSH介導的全部生物功能(包括皮膚色素沉著色調和惡性黑色素瘤細胞)的方法。

    最近,Jayawickreme等人在94年11月的J.of?Biol.Chem.269(47),29846-29854中鑒定了一系列多肽類α-MSH拮抗劑,例如八肽和九肽拮抗劑。然而,較大肽分子透過使人感興趣的組織的能力是有限的。因此需要小分子α-MSH拮抗劑,例如小于500道爾頓的拮抗劑,該拮抗劑最好易于擴散到組織結構中以調節α-MSH敏感組織。

    3.發明概述

    本發明提供α-MSH的肽類拮抗劑,進而為調節對α-MSH有響應的細胞和組織的功能提供了方法。本發明根據下面表1的活性α-MSH肽提供肽類拮抗劑。因此,本發明提供了α-MSH的這樣的肽類拮抗劑,它包含R-S-T序列,其中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時,R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。本發明還提供與所公開的肽類拮抗劑有類似結構的分子。

    本發明還提供一種方法,即通過將本發明的α-MSH肽類拮抗劑與α-MSH響應細胞或組織相接觸來抑制α-MSH活性。

    本發明還提供使動物皮膚外觀增白的方法,該方法是通過給需要此類治療的動物,例如哺乳動物如人,施用有效量的本發明的α-MSH肽類拮抗劑而完成的。提供了若干方法用于治療色素斑、痣、雀斑、黃褐斑,并可用于局部或全身的外觀增白美容。

    本發明還提供一種治療惡性黑色素瘤的方法,該方法是通過給需要此類治療的哺乳動物,例如人,施用有效量的本發明的α-MSH肽類拮抗劑而完成的。施用可以是局部的或全身性的。

    本發明還提供一種調節免疫系統的方法,該方法是通過給需要這種治療的哺乳動物,例如人,施用有效量的本發明的α-MSH肽類拮抗劑而完成的。

    在另一實施方案中,本發明提供一種根據下面表1中給出的活性α-MSH拮抗肽的肽類拮抗劑的藥物組合物。因此本發明提供具有R-S-T氨基酸序列的α-MSH拮抗劑。其中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時,R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。以及藥用載體。

    在一可選的實施方案中,本發明提供一種α-促黑激素的三肽拮抗劑,通過制備組合篩選文庫來鑒定該三肽拮抗劑,文庫中含有隨機結構的三肽分子文庫。該隨機組合篩選文庫再與α-促黑激素活性測試系統接觸,隨后鑒定出拮抗α-促黑激素活性的三肽分子。

    4.附圖描述

    圖1顯示由用于鑒定三肽拮抗劑的96個子文庫形成的組合篩選文庫的構成。縮寫:Abu,2-氨基丁酸;γ-Abu,4-氨基丁酸;ε-Abx,6-氨基己酸;Aib,2-氨基異丁酸;β-Ala,3-氨基丙酸;Orn,鳥氨酸;Hyp,反式羥脯氨酸;Nle,正亮氨酸;Nva,正纈氨酸。

    圖2A和2B顯示α-MSH拮抗劑反應的視頻圖像,這些圖像在第一位包含D-Trp的組合子文庫(即D-Trp子文庫)中的微珠上產生的。左圖(圖2A)顯示覆蓋有爪蟾黑色素細胞的6厘米瓊脂糖培養皿(Falcon產),這些細胞在剛好應用大約600個D-Trp子文庫的微珠之后,用褪黑激素(1Nm,30分鐘)和α-MSH(15Nm,30分鐘)預處理。60分鐘后(圖2B),由于鄰近微珠的局部釋放而顯示出白色環形圖案。

    圖3提供待測定拮抗劑的劑量響應曲線,這些拮抗劑被用于測試其對α-MSH誘導培養的爪蟾黑色素細胞中色素擴散的抑制能力。曲線圖顯示對3個肽A1(正方形),A4(實心三角形)和A6(空心圓形)(見表1)的抑制曲線的實例,這三個肽是通過擴散實驗鑒定的。在文庫篩選中沒有發現的另外兩個肽A9(實心圓)和A11(實心三角形)也被包括在內作為比較。通過測量透過1nM褪黑激素與處理的培養黑色素細胞的光透過率(Potenza等,1992,Anal.Biochem?206,315-22)和相應的邏輯方程曲線可對黑色素反應進行定量(De?Lean等,1978,Am.J.Physiol.235,E97-E102)。每一點代表4個相互獨立的測量值的均值和樣本標準差(SSD),這些測量值是在加入α-MSH(15Nm)和所需濃度的游離肽之后進行2小時后得到的。所得結果用占相應的單獨用α-MSH處理所得結果的百分數表示。

    圖4顯示D-Trp-Arg-Leu-NH2(dWRL)對α-MSH的競爭抑制作用。這個抑制作用通過Schild回歸分析得到證實(Arunlakshana等,1959,Br.J.Pharm.14,48-58)。平衡解離常數(pKc)是7.2±0.1M,回歸斜率是1.6±0.03。虛線顯示置信度為99%。

    圖5顯示圖4的劑量比率(dr),這些比率來自α-MSH中不加DWRL(空心圓形),加入1μM(實心菱形),10μM(空心三角形)和100μM(實心圓形)濃度的DWRL時的濃度響應曲線。(α-MSH單獨存在時EC50是2.5±0.3Nm,α-MSH與DWRL并存時EC50是4.8±0.6μM)。每個點代表四個獨立的透光率測試的均值和SSD。Ti=初始透光率(2分鐘)。Tf=最終透光率(60分鐘)。DWRL不引起血管活性腸肽(“VIP”)和8精加壓催產素(“AVT”)的EC50值的變化(此數據沒有列出)。

    圖6顯示D-Trp-Arg-Nle-NH2(dW-R-Nle)在40μM時阻斷α-MSH介導的cAMP第二信使刺激作用,但不阻斷AVT(8nM)激活的cAMP刺激作用。催產素拮抗劑GVT([d(CH2)5,Tyr(Me)2,Orn8]-加壓催產素;Peninsula產)在20μM時被用作阻斷由8Nm?AV激活的響應的對照。細胞內CAMP的測量是用在24孔組織培養平板(Falcon)中生長的匯合爪蟾黑色素細胞進行的。每個條線圖代表4個獨立測量值的均值和SSD。*(T-測試;P<0.001)對于全部測試組,帶星號者除外。

    圖7顯示人MSH受體受爪蟾成纖維細胞中dWRL的功能拮抗作用(Daniolos等,1990,Pigment?Cell?Res.3,38-43)。這些爪蟾成纖維細胞受到“Vector?alone”(pcDNAI/NEO,Invitrogen產)或含有人黑色素瘤MSH受體插入片段的“HMelMSHR”(pcDNAI/NEO)的轉染。對照=無附加藥物,MSH=5nMα-MSH,dWRL濃度=10μM,毛喉素=100μM毛喉素(7β-去乙?;?7β-[g-(N-甲基哌嗪)-丁酰);Calbiochem產)。

    圖8是一幅照片,用來表明局部施用三肽DWRL(1mM水溶液)到爪蟾皮膚使沉著色素的皮膚增白而形成“白化病樣”的膚色。

    圖9是一幅照片,用來表明給爪蟾作全身注射引起全身色素沉著皮膚的增白作用。給三只爪蟾注射了(40μM/kg)DWRL或D-Trp-Abu-Arg-NH2(對照),在20分鐘內,呈現出白化病樣的體表特征,如圖所示。三個對照爪蟾仍是黑色皮膚。

    圖10顯示6個活性最強的L-型分子在第3位置的結構功能的比較,這些分子是通過隨機篩選的辦法從第1位是D-Trp,第2位是精氨酸的子文庫中鑒定出來的。在隨機篩選中沒有發現的另外3個在第3位取代的分子也列于此作為比較。拮抗劑的活性與第3位的R基團的疏水性和電荷特征相關。

    5.發明詳述

    本發明涉及下面表1中活性α-MSH拮抗肽的肽類拮抗劑。因此,本發明提供調節響應α-MSH激素的細胞和組織的功能的α-MSH拮抗劑和方法。具體地說,本發明提供含有R-S-T序列的α-MSH肽類拮抗劑,其中R、S和T是氨基酸殘基,R選自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His,只是當S是Arg且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His;當S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu,且T是Nle或其酰胺化物時,R是D-Trp;當S是Arg,且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物時,R是D-Trp;S選自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu;T選自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。在優選的實施方案中,此多肽由10個,包括但不限于15個氨基酸。在另一實施方案中,此多肽包含不超過8個或不超過12個氨基酸殘基(包括氨基酸殘基衍生物或氨基酸類似物)。

    在另一個優選實施方案中,此類肽分子含有作為三肽的3個連續的氨基酸殘基(包括氨基酸殘基的衍生物或氨基酸類似物),其中這三個氨基酸殘基是下面表1中給出的活性α-MSH拮抗劑。本發明還提供這些肽的類似物和衍生物。

    本文所用術語“氨基酸”或“氨基酸殘基”是指天然存在的、非天然存在的或衍生的氨基酸殘基或具有氨基酸構象的分子。

    術語“肽”是指任何含有肽鍵的分子,它由天然存在的、非天然存在的或衍生的氨基酸殘基或具有氨基酸構象的分子組成。肽鍵是指連接兩個相鄰氨基酸殘基的酰胺鍵。

    在具體實施方案中,α-MSH拮抗劑是下述三肽分子之一:D-Trp-Arg-Leu;D-Trp-Arg-Nle;D-Trp-Arg-Nva;D-Trp-Arg-Met;D-Trp-Arg-D-Nle;D-Trp-Arg-Ile;D-Trp-Arg-Abu;D-Trp-Arg-Val;D-Trp-Arg-Arg;D-Trp-Arg-D-Arg;D-Trp-Lys-Nle;D-Trp-D-Arg-Nle;D-Trp-Leu-Nle;D-Trp-Nle-Nle;D-Trp-Ala-Nle;D-Trp-Met-Nle;D-Trp-Abu-Nle;D-Phe-Arg-Nle;D-Tyr-Arg-Nle;D-Ac-Trp-Arg-Nle;Trp-Arg-Nle和D-His-Arg-Nle?;固峁┝稅桓齷蚨喔鏨鮮鋈牡淖楹銜?。

    在另一實施方案中,肽的分子量小于500道爾頓。

    在另一實施方案中,肽可以是從隨機合成的組合文庫中通過篩選α-MSH拮抗活性得到的三肽α-MSH拮抗劑。作為示例,組合文庫可按Houghten等,1991,Nature354,84,Houghten等,1992,Biotechniques13,412或Jayawickreme等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,1614-1618的方法,文庫中合成的肽類具有隨機結構并且與α-MSH的同源性無關。限定“隨機”是為了使所得的肽不具有任何可預言的大小和任何位置的結構。本領域已知的其他隨機文庫也可用于鑒定α-MSH拮抗肽。篩選可按任何本領域中已知方法進行,并優選按下面實施例中所述進行篩選。

    這些肽以及構成肽的氨基酸不限于天然存在的20種氨基酸。非經典的氨基酸包括但不限于下述分子:普通氨基酸的D型異構體,α-氨基異丁酸,4-氨基丁酸,羥脯氨酸,肌氨酸,瓜氨酸,半胱磺酸,叔丁基甘氨酸,叔丁基丙氨酸,苯甘氨酸,環己基丙氨酸,β-丙氨酸,設計者(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸,Ca-甲基氨基酸,Na-甲基氨基酸,以及一般的氨基酸類似物。此外,氨基酸還包括:Abu,2-氨基丁酸;γ-Abu,4-氨基丁酸;ε-Abx,6-氨基己酸;Aib,2-氨基異丁酸;β-Ala,3-氨基丙酸;Orn,鳥氨酸;Hyp,反式羥脯氨酸;Nle,正亮氨酸;Nva,正纈氨酸。而且,氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)。而且,這些肽和/或氨基酸可以通過對基團的封閉而形成衍生物,包括但不限于乙?;?,在氨基末端羧基化,和在羧基末端酰胺化以提供被?;さ難萇?。

    通過組合篩選鑒定的α-MSH拮抗肽可用本領域中已知的方法制備。例如,簡單地說,有固相合成法,包括將C末端氨基酸的羧基偶聯到樹脂上并不斷加入N-α?;さ陌被?。?;せ趴梢允潛玖煊蛑幸閻娜魏我恢?。在每加入一個新的氨基酸到增長鏈之前,先前加入的氨基酸要脫?;?。將氨基酸偶聯到適當的樹脂的方法見Rivier等,美國專利4,244,946號。此類固相合成見例如Merrifield,1964,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Vale等,1981,Science?213:1394-1397;Marki等,1981,J.Am.Chem.Soc.103:3178和美國專利4,305,872和4,316,891號。在優選的方面中,使用自動肽合成儀。

    合成肽的純化按標準方法進行,包括層析(例如離子交換,親和層析,體積柱層析),離心,差示溶解度法或任何其他純化蛋白的標準技術。在優選實施方案中,可使用反相HPLC(高效液相層析)。

    本文公開的三肽拮抗劑的結構與功能的關系詳見附圖。其第3位氨基酸如圖10所示。參考此關系可制備有α-MSH拮抗劑活性的類似分子結構。因此,除了本文描述的肽類拮抗劑的結構、疏水性、電荷特征和側鏈性質外,本發明還試圖包括這些類似分子。

    5.1α-MSH拮抗劑具有治療和美容用途

    α-MSH肽類拮抗劑因其對α-MSH介導的功能有作用而具有治療和美容方面的用途。例如它可減輕皮膚色素沉著,調節免疫系統和治療黑色素瘤。

    “增白(lightening)”意指減輕皮膚中黑色素造成的色調,使皮膚變白。不希望被任何具體的作用機制所限制,據信肽類拮抗劑是α-MSH對α-MSH受體的競爭性抑制劑,可阻斷內源α-MSH的色素沉著作用。因此,存在于α-MSH響應細胞中的黑色素顆?;嵩訐?MSH拮抗肽的存在下由于對內源α-MSH受體的封閉而分散開。這會去除MSH對黑色素積累的增強效應。當局部施用這種肽時,施用肽的部位的皮膚就會變白。當全身施用這種肽時,全身皮膚表面的色調就會變淺。

    α-MSH拮抗肽可用于治療下述局部病癥,包括但不限于色斑、色塊如痣、胎記、雀斑、黃褐斑、炎癥后色素過度沉著。若需要的話,也可以以美容為目的進行局部和全身膚色增白,如前所述。

    通過將有效量的本發明的肽類拮抗劑給病人施用,α-MSH拮抗肽為治療惡性黑色素瘤提供了方法。

    通過給需要此治療的動物或人施用有效量的α-MSH肽類拮抗劑,本發明還提供調節動物或人的免疫應答的方法。

    此外,其他與不良α-MSH活性有關的疾病和臨床癥狀可用本發明的α-MSH拮抗肽進行治療。

    5.2α-MSH肽類拮抗劑的鑒定

    肽受體的藥物開發的常規方法常?;詼愿謀淶奶烊患ざ嶺慕峁溝納稈?,而且一般鑒定的是大分子。相反,如實施例中所述,本發明的α-MSH的小分子肽類拮抗劑是按照對Jayawickreme等人的擴散測試法的改進方法,通過篩選大量隨機小分子三肽鑒定的,這些小分子三肽是在多用途組合肽文庫(“MUPL”)的微珠的表面制備的,如Jayawickreme等人1994年J.Biol.Chem.269,29846-29854(“Jayawickreme?I”)和1974年,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91,1614-1618(“Jayawickreme?II”)所述,這兩篇文獻完整地在此引入作為參考。

    正如具體實施例中所述,所使用的方法可對載有隨機三肽分子的微珠的文庫進行篩選。生物檢測培養基由經過褪黑激素處理并在其上長有黑色素細胞的瓊脂糖凝膠組成。將微珠與瓊脂糖凝膠相接觸。用Jayawickreme?I和II(同上)的氣相釋放法進行肽分子從微珠上的受控釋放。5或10分鐘內觀察到由釋放的肽分子擴散誘導的色素分散,并用視頻圖像減除法監測。

    5.3治療和組合物

    本發明提供通過給受試者施用有效量的本發明的α-MSH拮抗肽而進行的治療。肽優選地是純化的。受試者優選是動物,例如哺乳動物,最優選地是人。

    已知有多種輸送系統,可用于施用本發明的α-MSH拮抗肽,例如水溶液、脂質體膠囊、微粒、微膠囊、受體介導的細胞噬粒作用(見Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262,4429-4432)。施用方法包括但不限于直接用于皮膚、皮內、肌肉內、靜脈內、鼻腔、硬膜外和口腔途徑。本發明的肽類可通過任何適當的途徑施用。例如輸注或單次快速注射,通過上皮或粘膜襯里(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜)。

    在具體的實施方案中,在需要任何上述方法治療的局部區域施用本發明的肽,結果也可能是理想的。

    本發明還提供藥物組合物。該組合物包含治療或化妝有效量的本發明的肽和藥用載體或賦形劑。載體包括但不限于水、鹽溶液例如生理鹽水、緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇以及它們的結合物。該制劑應適于所施用的方法。

    若需要的話,該組合物也可包含少量濕潤劑或乳化劑,或者pH緩沖劑。它可以是溶液劑、懸液劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋藥劑、膏劑、凝膠劑或粉末劑。它也可被制成栓劑,使用傳統結合劑和載體如甘油三酯??詵┛珊斜曜莢靨迦繅┢芳陡事洞?、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂。

    在具體實施方案中,該組合物可按常規方法制成適于給人靜脈注射用的藥物組合物。典型的靜脈注射組合物是無菌等滲緩沖液。必要時,此組合物中還可包含助溶劑和局部麻醉劑,以消除注射部位的痛感。一般地,各成分以單獨的或混合的單位劑量形式提供,比如裝在密封的容器(如示明活性藥劑量的安瓿或小袋)中的凍干粉末或無水濃縮物。用于輸注時,它可分裝到盛有藥品級無菌水或鹽水的輸液瓶中。作為注射液時,需要一安瓿的注射用無菌水或鹽水供注射前與藥物成分混合。

    本發明的α-MSH拮抗肽可制成中性或鹽的形式。藥用鹽包括那些與游離氨基形成的鹽,如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等形成的鹽,和與游離羧基形成的鹽,如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等形成的鹽。

    本發明的α-MSH肽類拮抗劑治療具體的失調癥或作為美容使用時的有效劑量取決于適于該失調癥或美容狀況的拮抗劑性質,并由標準臨床技術決定。此外,體外或體內測試可有任選地用來幫助確定最佳劑量范圍。制劑中所用的精確劑量還取決于施用途徑、疾病的嚴重程度、美容狀況并應當根據專業人員的判斷和患者的病情決定。有效劑量可根據本文提供的體外或動物模型測試系統所獲得的劑量響應曲線來推斷。

    根據本發明及對預期效果的觀察,按肽類拮抗劑的用藥劑量等級很容易確定α-MSH的肽類拮抗劑的有效劑量。這部分數據在下面表1和附圖2-9中給出。利用所提供的IC50濃度,代表性肽類的劑量響應曲線和體內實例,這些數據將有助于確定使膚色增白所需要的有效劑量。

    在一個實施方案中,在以例如膚色增白為目的局部制劑中,dWRL(D-Try-Arg-Leu)的有效濃度范圍在1μM到10mM之間。在優選的實施方案中,局部制劑的有效dWRL濃度范圍在100μM到5mM之間。在更優選的實施方案中,局部制劑的有效濃度范圍在500μM到2mM之間。在一具體實施方案中,局部制劑的有效濃度是1mM左右。

    在另一實施方案中,dWRL用于全身施用(例如皮膚增白)的有效劑量范圍在每公斤體重1-4000μM之間。在優選實施方案中,dWRL用于全身施用(例如皮膚增白)的有效劑量范圍是每公斤體重20-200μM。在更優選的實施方案中,dWRL用于全身施用(例如皮膚增白)的有效劑量范圍在每公斤體重30-100μM之間。在另一實施方案中,dwRL作全身施用時的有效劑量范圍是30-100μM。

    通過例如參考表1給出的顯示dWRL三肽的肽類拮抗劑相對效價的IC50值,就容易確定各種其他示例性三肽拮抗劑的有效濃度和劑量。

    在另一可選的實施方案中,本發明包括含有有效量的本發明的α-MSH拮抗肽的試劑盒。該試劑盒將含有一個或多個裝有至少一種本發明的α-MSH拮抗肽的容器。作為示例,該試劑盒可含α-MSH拮抗肽或用于皮膚,或通過皮下、肌肉內、靜脈內、鼻內、硬膜外給藥或口腔給藥的肽類。這種試劑盒可以含有溶液劑、懸液劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋劑、膏劑、凝膠劑或粉末劑形式的α-MSH拮抗肽。該α-MSH拮抗肽可以預先混合或是分開存放的易于混合的成分。它也可配制成一種肽的形式或藥物組合物,其中含有有效量的本發明的拮抗肽。

    本發明在下述實施例中將被進一步描述,這些實施例對本發明范圍沒有限制。

    6.實施例

    6.1三肽組合文庫的設計與構建

    人工合成的三肽隨機組合文庫是用Fmoc(芴基甲氧羰基)與MBHA(4-甲基-二苯甲胺)的化學交聯樹脂(置換率=9.5mM/g),如JayawickremeI和II所述,同上,并同時進行多個肽合成(Lam等,1991,Nature?354,83-84和Houghten等,Nature354,84-86)制備的。合成微珠子文庫中的三肽時要用到分離、偶聯和重組方法。

    每個子文庫可能含有2304(1×48×48)種三肽或類三肽序列組合。Z96代表構成每個子文庫的分子中第一個氨基酸位置(見圖1)。這個位置上的分子也屬于另2個位置中48種分子中的一種,或者是相應的乙?;?Ac)化等價物。位置2和3中的AA1和AA37代表20種左旋(沒有預固定化)氨基酸,除去半胱氨酸,加上18種相應的右旋(D)氨基酸異構體。再加上另外11種分子,總合為48。

    在用于篩選的制備中,約4%的掛珠分子在受控氣相三氟乙酸(TFA)裂解法作用下被分開。經過氣化NH3/H2O處理后作為直接用于生物檢測的無毒微珠。被分開的分子仍以非共價結合的狀態保持在微珠上,直到檢測時才被釋放出來。

    6.2功能性生物檢測

    按前述方法將爪蟾皮膚黑色素細胞保存在培養液中(Daniolos等,1990,Pigment?Cell?Res.3,38-43;Potenza等,1991,Pigment?Cell?Res.4,186-192和Karne等,1993,J.Biol.Chem.268,19126-19133)。將150萬個細胞接種到含有5毫升成纖維細胞培養基的6厘米組織培養平板(Falcon產)中,27℃培養至少48小時。在每次檢測時,要移除該培養基,換上3.5毫升0.9%的Sea?Plaque瓊脂糖。細胞要用褪黑激素(1nM,30分鐘)和α-MSH(15mM,2分鐘)預處理。每個子文庫中使用600顆微珠。這些微珠由一層2毫米厚的瓊脂糖與黑色素細胞隔開。只允許完全游離的分子與細胞表面發生作用。

    三肽誘導的色素轉移(擴散)有視頻圖像減除技術監測,此技術如McClintock等,1993,Anal.Biochem.209,298-305中所述。

    6.3肽測序

    將陽性區的微珠用N-甲基吡咯烷(“NMP”),二氯甲烷(“DCM”)和甲醇(“MeOH”)清洗后用作第二輪篩選帶有陽性反應信號的微珠。其間可將這些微珠零星散布在聚乙烯薄膜上進行篩選。從第一輪篩選得到的微珠用氣相三氟乙酸/NH3/H2O方法裂解成單個微珠。將這些陽性標記的單個微珠收集在玻璃纖維濾膜上,用NMP、DCM和MeOH洗。并用Applied?Biosystems?476A序列分析儀測序。

    6.4劑量響應研究

    為進行劑量響應研究,用標準Fmoc化學法在0.25mmol的Rink?AmideMBHA樹脂上合成全部三肽。合成后,用HPLC和C18柱反相層析法純化這些肽。用微量滴定板測定劑量響應曲線(Potenza等,1992,PigmentCell?Res.5,372-378)。將黑色素細胞(18,000/孔)放入96孔組織培養板(Falcon產)。檢測后,培養基用含有1nMα-MSH,1nM褪黑激素和不同濃度的三肽補充此培養基。測定對照組中,用Bombesin-[8-14]片段,催產素代替1nMα-MSH或將α-MSH置為空白。通過改變不同濃度三肽中的α-MSH濃度測出α-MSH劑量響應曲線或競爭抑制曲線。

    6.5結果

    按上述方法進行多用途肽文庫篩選法并以每顆微珠10pM釋放水平進行(占總量4%)。以便使低至100μM的分子反應效價也能被觀察到。這個有221,186種組分的文庫由96個子文庫組成,每個子文庫有2,304種肽分子組合。這些子文庫按其肽的氨基末端來區分。以D-色氨酸、右旋苯丙氨酸、左旋酪氨酸和乙酰右旋色氨酸為N末端的子文庫產生的反應曲線表明存在多種拮抗劑樣分子,其中具有右旋色氨酸末端的子文庫微珠產生的信號最多也最強(圖4)。當加入8nM?AVT([精氨酸8]-催產素,Sigma產;EC50≈2nM)或4nM?VIP(血管腸肽,Sigma產;EC50≈1nM)而不是15nM?α-MSH(Peninsula產;EC50≈2nM)時,沒有從這些子文庫中觀察到類似反應信號。

    經過擴散測試鑒定后,對待選拮抗劑進行再合成和純化(JayawickremeI和II,同上),并進行測定(圖2-9)。結果在表1中給出。對α-MSH來說,兩個最強的拮抗劑D-Trp-Arg-Leu-NH2(DWRL)和D-Trp-Arg-Nle-NH2的IC50值分別是620±150nM(均值±SE)和930±220Nm。這些拮抗劑屬于競爭性抑制并專一阻斷兩棲類內源α-MSH的誘導活性并對人類MSH受體起封閉作用(圖2-9)。三肽DWRL的平衡解離常數(Ke)是63±15Nm(圖2C),若按所預期的α-MSH的IC50值約是96Nm的話,測試中的α-MSH已達到其EC50值。

    ????????????????????????????????表1

    ?????????????????????肽序列???????????????????????????????????IC50(μM)A????????????D-Trp????????-Arg?????????-X????????????-NH2A1????????????????????????????????????Leu????????????????????????0.62±0.15A2????????????????????????????????????Nle????????????????????????0.93±0.22A3????????????????????????????????????Nva????????????????????????3.3±1.1A4????????????????????????????????????Met????????????????????????5.6±2.6A5????????????????????????????????????D-Nle??????????????????????9.9±1.8A6????????????????????????????????????Ile????????????????????????49±9A7????????????????????????????????????Abu????????????????????????82±41A8????????????????????????????????????Val????????????????????????237±100A9????????????????????????????????????Arg????????????????????????261±68A10???????????????????????????????????D-Arg??????????????????????664±397A11???????????????????????????????????γAbu??????????????????????無活性A12???????????????????????????????????εAhx??????????????????????無活性A13???????????????????????????????????Ala????????????????????????無活性A14???????????????????????????????????βAla??????????????????????無活性B??????????????D?-?Trp??-X????????????-Nle?????????-NH2B1?????????????????????Lys?????????????????????????????????15±1B2?????????????????????D-Arg???????????????????????????????30±11B3?????????????????????Leu?????????????????????????????????48±2.2B4?????????????????????Nle?????????????????????????????????59±12B5?????????????????????Ala?????????????????????????????????65±18B6?????????????????????Met?????????????????????????????????121±27B7?????????????????????Abu?????????????????????????????????405±69B8?????????????????????Asp?????????????????????????????????無活性C??????????????X????????-Arg??????????-Nle?????????-NH2C1????????????D-Phe????????????????????????????????????????4.4±1.2C2????????????D-Tyr????????????????????????????????????????28±2C3????????????Ac-D-Trp?????????????????????????????????????43±8C4????????????Trp??????????????????????????????????????????100±2C5????????????D-His????????????????????????????????????????318±105

    6.6結構-功能相關性

    除了鑒定那些易于對全身或局部的α-MSH活性起阻斷作用的分子量小于500Da的三肽拮抗劑外,同時還對各子文庫產生的多樣型拮抗劑信號進行了測試。從而有可能對拮抗劑結構的異同進行比較。通過比較可以確定和受體相互作用以及封閉作用相關的成分,而這方面的資料對進一步開發非肽類拮抗劑具有潛在應用價值。對右旋色氨酸子文庫的次級庫的篩選可推導出活性序列。

    例如,擴散測試反應曲線表明反應最強的分子的第2位氨基酸是精氨酸,而在第2位是其他氨基酸的次級子文庫中(如賴氨酸、右旋精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、正亮氨酸)則表現出較低的MSH受體拮抗劑樣活性。表1中,A1到A6顯示了篩選D-Trp-Arg-X子庫得到的6個反應最強的分子。

    經過擴散測試的鑒定之后,對待選拮抗劑進行再合成和純化(Jayawickreme?I和II,同上)并進行測定(圖2-9)。相對于15nMα-MSH來說,兩個最強的拮抗劑D-Trp-Arg-Leu-NH2(dWRL)和D-Trp-Arg-Nle-NH2的IC50值分別是620±150nM(均值±SE)和930±220Nm。這些拮抗劑屬于競爭性抑制并專一阻斷兩棲類內源α-MSH的誘導活性并對人類MSH受體起封閉作用(圖7-9)。肽dWRL的平衡解離常數(Ke)是63±15nM(圖5),若按所預期的α-MSH的IC50值約是96的話,測試中的α-MSH已達到其EC50值。

    多樣型MSH受體拮抗劑分子是從D-Trp-Arg-X次級子庫中篩選出的,后者形成一系列結構上相關的肽分子(圖10)。它們構成了可替換的結構,其活性不會由于第3位氨基酸的結構差異而退化。在這組肽中,IC(抑制濃度)測量值反映出拮抗劑效價與碳氫側鏈長度正相關,即正亮氨酸>正纈氨酸>2-氨基丁酸>丙氨酸,并與β-甲基的存在負相關,如正纈氨酸>異亮氨酸;2-氨基丁酸>纈氨酸。從亮氨酸中去除γ-甲基使拮抗劑效價比正纈氨酸低50%。當甲硫氨酸在第3位時要比有類似R基團但是非硫化的正亮氨酸效價減少6倍。在電荷取代試驗中,親水性最強的是精氨酸,其效價比正亮氨酸低300倍(見表1,A)。右旋異構體子庫反應也是陽性,但與左旋異構體子庫相比,其效價已經降低了。右旋正亮氨酸比在第3位的左旋異構體的效價高10倍。

    大部分從擴散測試中篩選到的三肽沒有表現出類似的α-MSH拮抗活性。雖然預計受體和配體之間有高度專一性,但大部分得到的是陰性結果。大部分測試的文庫缺乏活性說明位置1的改變不能很好地服從受體作用范疇。除右旋色氨酸外,在非乙?;目庵芯橢揮杏倚彼岷透〕潭壬嫌倚野彼嵯允境隼嗨痞?MSH拮抗劑活性。在發現它們也是X-Arg-Nle-NH2通式中位置1的2個最有效可替換氨基酸之后,這個觀察結果得到確認(見表1,C1和C2)。此處X代表圖1中全部48種非乙?;楹銜?。

    因此,在篩選時觀察到陽性信號的增加可能是由于其結構上類似于右旋色氨酸文庫中的陽性反應分子而不是其他無關結構。在右旋色氨酸文庫的子文庫中也明顯觀察到類似的陽性增加現象。在D-Trp-X-Nle-NH2結構中將X換成賴氨酸,右旋精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和正亮氨酸可產生有拮抗劑活性的多肽(見表1,B1和B5)而且正如所預期的,其效價要比用精氨酸低。因此,隨機篩選所得到的肽由于其具有最強的信號,而成為事實上這個文庫中最有效力的MSH受體拮抗劑。組合篩選中各種變化因素,例如,微珠的大小對信號強度差異的影響要比不同效價氨基酸的次序改變的影響要小。

    6.7環腺苷酸的定量

    測試前2天,將黑色素細胞鋪到24孔組織培養板(Falcon產)中。在臨測試前,用含有0.05%小牛血清白蛋白的70%L-15培養基(Sigma產)清洗細胞。然后用在同樣培養基中的1nM褪黑激素處理細胞。再用70%L-15+0.05%小牛血清白蛋白+0.5mM?3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Aldrich產)+1nm褪黑激素的混合物洗5分鐘,再用配有測試藥劑的同樣培養基處理30分鐘。經藥劑處理后的細胞用70%磷酸鹽緩沖的鹽水洗2次。

    如圖6所示,D-Trp-Arg-Nle-NH2(dW-R-Nle),在40μM下,封閉α-MSH(10nM)介導的cAMP第二信使刺激作用,但不封閉由AVT(8nM)激活的cAMP刺激作用。催產素拮抗劑GVT([d(CH2)5,Tyr(Me)2,Orn8]-加壓催產素;得自Peninsula),在20μM下,被用作8nM?AVT激活的封閉應答的對照。

    6.8爪蟾成纖維細胞中dWRL對人MSH受體的功能性拮抗作用

    為證明人MSH受體受三肽拮抗劑的抑制,將爪蟾成纖維細胞用表達人MSH受體的載體轉染,在三肽存在和不存在時,測定cAMP反應,如圖7所示。

    爪蟾成纖維細胞(Daniolos等,1990,Pigment?Cell?Res.3,38-43)用“Vector?alone”(pcDNAI/NEO,Invitrogen產)轉染或用“HMelMSHR”(pcDNAI/NEO含插入的人黑色素瘤受體)轉染(Mountjoy等,1992,Science?257,1248-1251;Roger?Cone贈送)。對照=無附加藥劑。MSH=5nM?μM?α-MSH。dWRL濃度是10μM。毛喉素=100μM毛喉素(7β-脫乙?;?7β-[g-(N-甲基哌嗪子基)-丁酰;Calbiochem產)。

    轉染是用電穿孔進行的(≈5×10-6細胞/400μl?70%磷酸鹽緩沖的鹽水中,pH7.0,加10μg待測cDNA)使用BTX?ECM-600(475V,720?ohm,400μF)的0.2厘米試管。轉染48小時后,平鋪在12孔組織培養板(Falcon產)的融合細胞用含有0.5%小牛血清白蛋白BSA(Sigma產)的70%L-15培養基洗5分鐘。再用加有0.5mM?IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,Aldrich產)洗5分鐘。在IBMX存在時,加入測試藥劑,每孔加1毫升60%乙醇抽提cAMP。cAMP來自cAMP結合蛋白(21;Amersham產試劑盒)。每個條線代表三次獨立測定的均值和SSD,而對照-HMelMSHR測試組n=6。除帶有單星號的其他組外,對所有組均為*(T-Test;p<0.006),對其他組均為**(T-Test;p<0.006)。

    如圖7所示,與僅用MSH處理hMel?MSHR轉染的細胞相比,三肽對hMel?MSHR(人黑色素瘤MSH受體)轉染的細胞中cAMP形成有更明顯的抑制作用。

    6.9皮膚增白的局部效果

    為表明色素增白是在皮膚水平被局部誘導的,dWRL(1mM水溶液)被局部施加到爪蟾的皮膚表面(圖8)。在施加部位出現較輕的白化病樣皮膚色調。這些結果表明本發明的肽可以透皮作用,并在暗適應的正常條件下,在體內由內源促黑激素介導增強的著色作用,這種影響的去除賦予青蛙較輕的“白化病樣”狀態。

    6.10皮膚增白的全身性效應

    為確證α-MSH對增強皮膚色調的作用,給暗適應的爪蟾注射dWRL(40μM/Kg)或D-Trp-Abu-Arg-NH2(對照組)。dWRL在20分鐘內引起每只受試爪蟾(n=8)全身增白作用,但在對照組(n=8)則無變化(圖9)。

    本發明不受本文描述的具體實施方案范圍的限制。實際上,除本文描述的之外,根據前面描述及相關數據作出本發明的各種改動對本領域技術人員也是顯而易見的。這些改動也屬于權利要求的范圍。本文引述了不同的出版物,其公開內容在此完整地引入作為參考。

關于本文
本文標題:?。俸詡に剞卓辜良跋喙胤椒?pdf
鏈接地址://www.vmyqew.com.cn/p-259834.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 www.vmyqew.com.cn網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開